Experiment 5. 7) Restriction enzyme mapping of cloned DNA

Experiment 5

실험제목: 7) Restriction enzyme mapping of cloned DNA

 

1. Purpose

cDNA가 vector내로 잘 들어갔는지 다시 한 번 확인하는 작업이다.

일부 제한효소는 방향이 역방향이 되기도 한다.

 

2. introduction

Restriction Mapping이란 정체불명의 DNA에서 제한 효소 절단 부위들의 상대적 위치를 찾아내는 과정을 뜻한다. 이러한 Mapping 작업은 Restriction Enzyme의 특정 위치를 자르는 특성에 의해 DNA가 잘라지고 그에 의해 잘라진 DNA fragment들의 크기를 Electrophoresis를 통해 알아내는 것에 기초를 둔다. 가장 흔한 방법으로 몇몇 Restriction Enzyme을 가지고 단독으로 잘라보거나 조합해서 잘라보고 fragment들을 분석하여 Mapping 것이 있다. 이 방법은 실험과정이 간단하고 쉽게 적용되는 장점을 지닌다.

 

3. Material & Method

◇ 재료

첫 번째 실험- plamid DNA 2㎕, 6x loading dye buffer 2㎕, dH20 8㎕

두 번째 실험- Plasmid DNA 5㎕, 10X buffer 1㎕, EcoR1(GmFT제한효소) or BamH1(GmTFL1제한효소) 0.5㎕, ddH20 3.5㎕

 

◇ 방법

① 우선 2㎕ plasmid를 전기영동을 해서 원하는 DNA가 prep가 되었는지 확인한다.

② 확인 후 ddH2O 3.5㎕를 먼저 넣어주고, 10X enzyme Buffer 1㎕와 EcoR1(GmFT),BamH1(GmTFL1)를 각각 0.5㎕ 넣어준 뒤 Plasmid DNA 5㎕를 넣는다.

③ 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에 보관

④ 튜브에 6x Loading dye buffer 2㎕ 넣어 주고 손가락으로 튕겨준다.

⑤ 전기영동을 이용한 후 UV 사진기에서 출력 한 뒤 파란색 선이 나오는 위치를 비교해 보면, 그 cDNA가 역 방향으로 되었는지 안 되었는지 알 수 있다.

⑥ cDNA 염기 서열을 파악하기 위해서 회사에 보낸다.

 

4. Result

cDNA가 역 방향으로 들어가지 않고 똑바로 잘 들어가서 원하는 형태로 잘 배양되었다.

이전 실험보기

Experiment 1. 

Amplification of interesting gene using PCR

Experiment 2. 

2) Elution of PCR product from agarose gel

3) Preparation of cloning vector(pBluescript)

4) Ligation of PCR product and vector

Experiment 3. 

5) plasmid transformation into E.coli(DH5α)

Experiment 4. 

6)Plasmid (mini) preparation from E.coli(Alkalilysis method)