Experiment 4. 6)Plasmid (mini) preparation from E.coli(Alkalilysis method)

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Experiment 4

실험제목: Plasmid (mini) preparation from E.coli(Alkalilysis method)

 

1. Purpose

E.coli에 삽입시킨 Plasmid를 Alkalilysis method을 통해서 Bacteria의 세포벽과 세포막을 파괴해서 넣은 plasmid를 추출한다.

2. introduction

E.coli Bacteria안 에는 Bacterial Chromosome과 Plasmid vector에 Ligation한 plasmid라는 두가지 DNA가 존재를 한다. 여기에서 Bacterial Chromosome를 제외한 Plasmid vector에 Ligation한 plasmid를 추출해야한다. 그때 사용되는 방법을 소개하고자 한다.

 

Solution 1: 50mM Glucose(삼투압유지), 10mM EDTA(세포막단백질에서 Ca2+이온을 제 거하는 역할을 한다.), 25mM Tris-HCl (pH 8.0) (반응시에 pH를 안정화 시킨다.) 세포막을 느슨하게 하고, 원형의 박테리아를 만들어서 세포막을 유지시킨다.

Solution 2: 1%(w/v) SDS(남아 있는 세포막을 파괴시키고, 변성시킨다.), 0.2N NaOH(변 성시킨다.) 원형을 유지하고 있는 bacteria의 membrane을 파괴 시키고, 변성시킨다.

Solution 3: 5M Potassium Acetate(pH 5.6) pH를 중성으로 만들어서 size가 작은 Plasmid만 원래대로 되돌아온다.

3. Material & Method

◇ 재료

Solution1(50mM Glucose, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl (pH 8.0))

Solution 2 (1%(w/v)SDS, 0.2N NaOH)

Solution 3(5M Potassium Acetate(pH 5.6))

E.coli(DH5a)에 transformation시킨 Plasmid (블루색으로 염색된 transformed bacteria-control, PI-흰색, clark-흰색), Centrifuge, microcentrifuge, isopropanol, Ethanol, TE Butter, H2O, 6X DNA dye

 

◇ 방법

① Over night 해서 증식 시킨 대장균 중 흰색 한 부분을 살균에 유의해서 액체배지에 옮겨 증폭시킨다.

② 1.5ml만 빼서 튜브에 넣어서 원심분리기에 30초간 돌려서 대장균만 응축시킨다.

③ 상층액 부분의 액체를 빼어낸 뒤 solution 1(100㎕l)를 넣어주고 섞이게 vortex 이용한다.

④ 200㎕l soultion 2을 넣어 준 뒤 손가락으로 털어서 섞이게 한다.

⑤ 150㎕l soultion 3을 추가 한 뒤 손가락으로 살살 털어서 섞으면 Bacterial Chromosome 가 서로 엉키게 되고 깨끗한 상층액만 뽑아서 깨끗한 튜브에 옮겨 담는다.

⑥ 100% isopropanol을 넣어서 실온에 보관하면 5분 동안 나둔 뒤 10분간 원심분리기에 돌리면 우리가 필요로 하는 플라스미드가 서로 엉키게 되고 나머지 액체 액은 버린다.

⑦ 80% Ethanol 500㎕l을 넣어서 플라스미드 사이에 있는 수분을 빼주게 된다.

⑧ 5분간 원심분리기에 돌린 뒤 액체 액을 버린 뒤 뚜껑을 열어 남아 있는 에탄올을 증산시킨다.

⑨ TE buffer에 넣어 다시 뭉쳐있는 플라스미드를 녹인 뒤 보관을 한다. 

4. Result

white colony가 들어있는 것을 전기연동 하여서 광을 쬐여준 결과 EtBr이 들어 있는 UV광을 쬐였을 때 1개만 제외 하곤 줄이 선명하게 나타났다. 성공적인 실험이었다. 그리고 우리가 이 과정을 통해서 원하는 DNA 만을 얻을 수 있었다.

  

5. Reference

작물분자유전학 실험 프린트물, 필기 참조

위키백과사전(인터넷)

유전학의 이해(라이프사이언스)-전상학외4명

필수유전학(월드사이언스)-송동민 외12명

유전학원론(월드사이언스)-Simmons, Michael J.

최신 유전학(범하서적)-Simmons, Michael J. 외5명

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Experiment 1.
    Amplification of interesting gene using PCR

Experiment 2.
    2) Elution of PCR product from agarose gel
    3) Preparation of cloning vector(pBluescript)
    4) Ligation of PCR product and vector

Experiment 3.
    5) plasmid transformation into E.coli(DH5α)