Experiment 2. 2) Elution of PCR product from agarose gel/3) Preparation of cloning vector(pBluescript)/4) Ligation of PCR product and vector

<본자료는 실험을 통한 개인보고서 이므로 참고용으로만 보세요>

Experiment 2.

실험제목: 2) Elution of PCR product from agarose gel

3) Preparation of cloning vector(pBluescript)

4) Ligation of PCR product and vector

 

 

1. Purpose

    PCR 전기영동으로 확인, Gel elution, ligation.

 

2. introduction

전기 영동을 시킨 DNA를 Gel상태에서 Elution시킨다. promoter부분인 Clark의 P34 Promoter Fragment 1와 PI의 P34 Promoter Fragment 1를 각각 동일한 제한효소로 처리된 T-vector에 삽입하는 것(형태는 DNA end의 두가지 형태 중에 blunt end를 사용)이 위 두 실험이다.

 

3. Material & Method

*재료

Vector 1㎕l, T4 DNA ligase (Vector와 PCR product을 결합해주는 데 쓰임)

10X ligase buffer 2㎕, ddH20 9㎕, Agarose gel, GB buffer(Agarose gel을 녹여줌)

*방법

2) Elution of PCR product from agarose gel

① 원하는 DNA가 잘 증폭이 되었는지 5㎕만 먼저 전기영동을 해서 잘 나왔는지(500~600bp line 사이에 있는지) 확인 한 뒤, UV 사진기로 확인 한 뒤, 남은 45㎕l을 6X dymer와 섞어 파란색으로 만든 뒤 전기영동을 해준다. (총 4개: FT 2개 FTL 2개)

② 전기영동을 거쳐서 Agarose gel에 만들어 진 파란색 line (DNA 밴드)을 mes로 잘라 내어준다.

③ 잘려진 Agarose gel을 녹여 주기 위해 3 volume 으로 GB buffer를 넣어준다.

④ 인큐베이트에 50℃에 10분간 넣어준다.

⑤ 녹은 DNA을 spin column에 넣어 주고, 원심 분리기로 30초간 돌려주어 spin column 밑 부분에 나온 필요 없는 부분의 액체 액을 버려준다.(크기가 크기 때문에 뚜껑을 자른 다름 원심분리기에 넣는다.)

⑥ 다시 700㎕l의 NW buffer를 넣어 30초간 돌려 다시 나온 액을 버림.

⑦ 1분30초간 추가적으로 원심 분리기에 돌려 미처 빠져나가지 못한 불순물을 제거해 준 뒤 깨끗한 튜브로 옮겨줌

⑧ EB buffer 50㎕l를 넣어서 1분간 충분이 적셔질 시간을 준 다음 원심분리기에 돌리면 DNA가 빠져 나오게 된다.

 

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3) Preparation of cloning vector(pBluescript)

① 위에 과정에서 만들어진 DNA(PCR product) 7㎕l를 준비한다.

② Vector 1㎕l(pBluescript SK plasmid: Sma1,Blunt end)을 넣고 T4 DNA ligase 1㎕와 10X ligase buffer 2㎕l와 농도를 맞춰주기 위해서 3차 증류수 9㎕l을 집어 넣어준다. (Total: 20㎕l)

③ liagiton 혼합물을 4℃ over night 해준다.

 

 

4. Result

    정교한 Elution 작업을 거치면서 확실히 원하는 부분만 잘 추출이 되었다.

 

5. Discussion

우리 조원이 Agarose gel를 필요한 부분만 잘 잘라서 다른 조에 비해 필요한 500bp 부분이 하얗게 깨끗하게 잘 나왔다.

 

6. Reference

작물분자유전학 실험 프린트물, 필기 참조

위키백과사전(인터넷)

유전학의 이해(라이프사이언스)-전상학외4명

필수유전학(월드사이언스)-송동민 외12명

유전학원론(월드사이언스)-Simmons, Michael J.

최신 유전학(범하서적)-Simmons, Michael J. 외5명

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  Amplification of interesting gene using PCR