Experiment 1. Amplification of interesting gene using PCR

<본 실험은 개인이 실험후 작성한 보고서 이므로 참고용으로만 이용세요>

Experiment 1.

실험제목: 1) Amplification of interesting gene using PCR

 

1. Purpose

Arabidopsis의 FLOWERING LOCUST (FT)(개화촉진 유전자), RERMINAL FLOWER 1 (TFL1)(개화억제 유전자)가 콩 sequence에도 있는 지를 확인하고 콩에 있는 비슷한 서열의 유전자가 Arabidopsi의 유전자의 형질을 나타내는지 알아보기 위해 PCR을 통해 필요한 유전자 서열을 증폭.

 

2. introduction

DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다

3. Material & Method

◇ 재료

(cDNA 2㎕, 5' Primer - 1㎕ x4 3' Primer - 1㎕, 5X Buffe - 10㎕, dNTP Mixture - 4㎕, Prime Star DNA Polymerase 0.5㎕, dH2O - 32.5㎕) X4, Loading buffer(glycerol +bromo-3phenol blue(BPB)) 2㎕, PCR Product 5㎕, dH2O 5㎕

 

◇ 방법

polymerase-chain-reaction(PCR) 만들기

① 총 4개의 튜브를 준비하고 각각 2개씩 GmFT 와 GmTFL로 GmFT(1~2번), GmTFL(3~4번)으로 주기표시를 한다.

② Template(cDNA)를 2㎕씩 각 튜브에 주입한다.

③ cDNA가 들어있는 튜브에 5’-primer 과 3’-primer을 각각 1㎕씩 주입.

GmFT (S=MG-982, AS=MG-984)

GmTFL(S=MG-618, AS=mg-619)

④ 5X buffer를 10㎕씩 넣는다.

⑤ dNTP mixture를 4㎕씩 넣는다.

⑥ dH2O를 31.5㎕ 넣는다.(이는 5X의 buffer를 희석시키기 위해 31.5㎕를 넣음)

⑦ prime star DNA Polymerase를 0.5㎕를 넣는다.

⑧ Total Volume이 50㎕가 되어야 한다.

⑨ PCR base기계에 94℃에 2분간 돌려준다. 이는 Pre-denaturation 과정이다.

⑩ 94℃ 에 30sec 는 denaturation과정이다.

⑪ GmFT 는 55℃에 30sec, GmTF는 60℃ 30sec를 돌려 준다. (annealing 과정)

⑫ 72℃ 30sec 이는 extension 과정.

⑬ 10~12번 과정을 반복하여 DNA를 증폭시키는 과정이다.

⑭ 남은 72℃ 10min을 돌려서 아직 다 만들어지지 않은 DNA 남은 부분을 보완하는 과정을 거친다.

⑮ 4℃에 보관

 

 4. Result

전기영동을 통해서 나온 결과는 TFL1은 500bp 자리에서 깨끗이 잘 나온 반면 FT는 하나는 안 나오고 하나는 희미하게 나왔다.

5 primer가 첫 번째 조원 실험자가 많이 사용하여 두 번째 실험자 사용할 양이 부족해 결과가 나오지 않은 것 같다.

 

PCR후 전기영동_DNA 5ul

5. Discussion

처음으로 PCR에 대해서 실험을 처음이라서 많은 것을 알수는 없었지만 pcr이 무엇인지는 확실히 배운것 같다. 그래도 오늘은 이정도만 알아도 어느 정도의 성과가 있는 것 같다. 역시 실험을 해보아야 그 과목을 알수 있는것 같다. 또한 cDNA는 필요한것만 볼수 있게 도와주는 역할을 하며 항상 5X buffer는 1X로 만들어사용 해야해야만 좋은결과가 나온다는 것 알았다.

 

6. Reference

작물분자유전학 실험 프린트물, 필기 참조

위키백과사전(인터넷)

유전학의 이해(라이프사이언스)-전상학외4명

필수유전학(월드사이언스)-송동민 외12명

유전학원론(월드사이언스)-Simmons, Michael J.

최신 유전학(범하서적)-Simmons, Michael J. 외5명

 다음실험 연결보기

• Experiment 2.
   2) Elution of PCR product from agarose gel
   3) Preparation of cloning vector(pBluescript)
   4) Ligation of PCR product and vector