Experiment 3. 5) plasmid transformation into E.coli(DH5α)

Experiment 3

실험제목: plasmid transformation into E.coli(DH5α)

 

1. Purpose

조합된 DNA를 E.coli(DH5α)에 transformation한다.

 

2. introduction

Normal bacterium을 calcium chloride(CaCl2)를 처리해서 Normal bacterium의 membrane을 느슨하게 해준다. Ligation한 Plasmid를 넣고, ice처리를 해서 bacterium에 잘 들어갈 수 있도록 한다. 그 다음 heat shock 42℃를 2분 정도 처리(Plasmid가 bacterium에 쏙 들어가게 한다)후에 바로 ice상태로 2분 처리한다. 그러면 bacterium의 membrane이 쏙 닫힌다. 그렇게 만든 transformed cell을 Incubate에 37℃로 해서 1시간동안 처리를 한다. 이렇게 하는 이유는 에제 Ligation한 Plasmid에 있는 항생제 저항성 유전자의 활성과 E.coli(DH5a)에 넣은 Plasmid를 회복시킨는 것이다.

Selection하는 방법을 소개하면, 1.항생제를 이용한 selection, 2.LacZ를 이용한 color selection

1.항생제를 이용한 selection 방법은 Ampicillin처리를 함으로 해서 Ligation을 통해서 만든 Plasmid vector가 PI, clark promoter sequence가 들어간 것과 그렇지 못한 것에 대한 selection방법이다. 이 방법은 Antibiotics resistance gene이 포함되지 않은 Plasmid만 부분이 가능하고, Antibiotics resistance gene이 포함된 Plasmid가 있으나 recombinant gene이 없는 Plasmid와 Antibiotics resistance gene이 포함된 Plasmid가 있고 recombinant gene을 포함한 것과는 구분을 하지 못한다.

그래서 2.LacZ를 이용한 color selection방법을 이용한다. 이방법은 LacZ 유전자 부분이 발현되는 경우와 발현되지 못하는 경우를 통해서 구분하는 것이다. 우리가 Ligation할 때 LacZ부분에 유전자를 넣어기 때문에 발현되지 않는 것이 실험에서 얻고자 하는 cell이다.

이 방법의 원리는 Lac Operon에서 inhibitor라는 유전자 발현 저해 단백질이 lactose와 결합해서 β-galactosidase를 합성 시키는것인데, 이때 lactose라는 물질이 부족하게 되면 만들어진 유전자 발현 저해 단백질인 inhibitor가 LacZ유전자의 operon부분에 붙어서 유전자 발현을 억제한다. 이러한 원리를 이용하여 실험에서는 lactose 대신에 X-gal를 넣고, IPTG도 넣어준다. IPTG는 inhibitor(유전자 발현 억제 단백질)와 결합해서 LacZ 유전자 발현을 억제하지 않는다. LacZ 유전자로 발현된 α-fragment와 E.coli(DH5a)가 결합해서 β-galactosidase가 만들어진다. 이것이 만들어져서 lactose 대신 넣은 X-gel이 blue색을 염색시키는 것과 glucose로 분해된다. 우리가 Ligation을 통해서 만들어진 Plasmid는 LacZ 유전자 안에 PI, clark promoter을 넣어기 때문에 LacZ 유전자가 발현되지 못해서 α-fragment와 E.coli(DH5a)가 결합해서 β-galactosidase을 만들지 못해서 cell이 무색으로 나타나고, LacZ 유전자가 정상적으로 작동하는 것은 blue색으로 나타난다. 우리가 얻으려고 하는 것은 무색으로 보이는 Cell이다.

 

3. Material & Method

◇ 재료

Incubate, Ice box, Water bath, Ligation한 Plasmid, E.coli(DH5a)-100ul, LB(액체배지)-900ul, LB(고체배지), Ampicillin-40ul, IPTG-40ul(0.5M), X-Gal-60ul, Plate

 

 

◇ 방법

5) plasmid transformation into E.coli(DH5α)

①고체로 된 LB배지(액체 LB에 agar 첨가)를 전자렌지에 넣어서 액체로 만들어 준 다음 페트리 dish에 분배해서 넣어 주고 다시 식을 때 까지 멸균 된 곳에 보관한다.

②competent cell(일반 셀에 칼슘이온을 집어넣어서 세포벽을 느슨하게 만들어 준 것) 100㎕씩 4개 튜브에 넣은 후 4℃에 10분간 보관해서 plasmid가 competent cell 세포벽에 잘 붙게 해준다.(차갑게 해주면 heat shock 효과가 더 커짐)

③ 42℃ 워터베이스에 2분간 heat shock 시켜준다.

④ 다시 4℃에 3분간 넣어 준 다음 transformed cell의 회복을 위해 37℃ 40분간 200rpm해준다.

⑤만들어 진 고체 배지 페트리 dish 위에 transformed cell을 100㎕ 씩 넣어준 다음 X-Gal 60㎕, IPTG 40㎕, 액체 LB, ampicilin 을 넣어 준 다음 마르기 전에 구슬을 넣어서 액체가 고루 퍼지게 하고, 만약 마르게 될 시, 물을 넣어 준다.

⑥37℃에서 하루 종일 인큐베이터에 보관한 후 흰색 클론들만 선택한다.

 

Transformation_GmFT

Transformation_GmTFL

 

5. Reference

작물분자유전학 실험 프린트물, 필기 참조

위키백과사전(인터넷)

유전학의 이해(라이프사이언스)-전상학외4명

필수유전학(월드사이언스)-송동민 외12명

유전학원론(월드사이언스)-Simmons, Michael J.

최신 유전학(범하서적)-Simmons, Michael J. 외5명