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  • Experiment 2. 2) Elution of PCR product from agarose gel/3) Preparation of cloning vector(pBluescript)/4) Ligation of PCR product and vector
    ■ UNIVERSITY STUDY |대학공부/실험 · 실습 2017. 11. 2. 05:11

    <본자료는 실험을 통한 개인보고서 이므로 참고용으로만 보세요>


    Experiment 2.

    실험제목: 2) Elution of PCR product from agarose gel

    3) Preparation of cloning vector(pBluescript)

    4) Ligation of PCR product and vector

     

     

    1. Purpose

        PCR 전기영동으로 확인, Gel elution, ligation.

     

    2. introduction

    전기 영동을 시킨 DNAGel상태에서 Elution시킨다. promoter부분인 ClarkP34 Promoter Fragment 1PIP34 Promoter Fragment 1를 각각 동일한 제한효소로 처리된 T-vector에 삽입하는 것(형태는 DNA end의 두가지 형태 중에 blunt end를 사용)이 위 두 실험이다.

     

    3. Material & Method

    *재료

    Vector 1l, T4 DNA ligase (VectorPCR product을 결합해주는 데 쓰임)

    10X ligase buffer 2, ddH20 9, Agarose gel, GB buffer(Agarose gel을 녹여줌)

    *방법

    2) Elution of PCR product from agarose gel

    원하는 DNA가 잘 증폭이 되었는지 5만 먼저 전기영동을 해서 잘 나왔는지(500~600bp line 사이에 있는지) 확인 한 뒤, UV 사진기로 확인 한 뒤, 남은 45l6X dymer와 섞어 파란색으로 만든 뒤 전기영동을 해준다. (4: FT 2FTL 2)

    전기영동을 거쳐서 Agarose gel에 만들어 진 파란색 line (DNA 밴드)mes로 잘라 내어준다.

    잘려진 Agarose gel을 녹여 주기 위해 3 volume 으로 GB buffer를 넣어준다.

    인큐베이트에 5010분간 넣어준다.

    녹은 DNAspin column에 넣어 주고, 원심 분리기로 30초간 돌려주어 spin column 밑 부분에 나온 필요 없는 부분의 액체 액을 버려준다.(크기가 크기 때문에 뚜껑을 자른 다름 원심분리기에 넣는다.)

    다시 700lNW buffer를 넣어 30초간 돌려 다시 나온 액을 버림.

    130초간 추가적으로 원심 분리기에 돌려 미처 빠져나가지 못한 불순물을 제거해 준 뒤 깨끗한 튜브로 옮겨줌

    EB buffer 50l를 넣어서 1분간 충분이 적셔질 시간을 준 다음 원심분리기에 돌리면 DNA가 빠져 나오게 된다.

     


    3) Preparation of cloning vector(pBluescript)

    위에 과정에서 만들어진 DNA(PCR product) 7l를 준비한다.

    Vector 1l(pBluescript SK plasmid: Sma1,Blunt end)을 넣고 T4 DNA ligase 110X ligase buffer 2l와 농도를 맞춰주기 위해서 3차 증류수 9l을 집어 넣어준다. (Total: 20l)

    liagiton 혼합물을 4over night 해준다.

     

     

    4. Result

        정교한 Elution 작업을 거치면서 확실히 원하는 부분만 잘 추출이 되었다.


     

    5. Discussion

    우리 조원이 Agarose gel를 필요한 부분만 잘 잘라서 다른 조에 비해 필요한 500bp 부분이 하얗게 깨끗하게 잘 나왔다.

     

    6. Reference

    작물분자유전학 실험 프린트물, 필기 참조

    위키백과사전(인터넷)

    유전학의 이해(라이프사이언스)-전상학외4

    필수유전학(월드사이언스)-송동민 외12

    유전학원론(월드사이언스)-Simmons, Michael J.

    최신 유전학(범하서적)-Simmons, Michael J. 5



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